Cell重磅：可基因编码的光记录电压探针！

　　编译作者：济沧海（brainnews 创作团队），校审：Simon（brainnews 编辑部）

　　动物在运动时，如果能通过光记录带有基因标记的单个神经元电活动，将极大地有助于人们理解神经系统是如何处理信息的。

　　基因编码的荧光电压指示剂GEVIs)可以展示神经元非尖峰的电活动，并以亚毫秒级的分辨率解决尖峰计时问题，而这是基因编码的荧光钙离子指示剂GECIs)无法完成的任务。

　　多光子显微镜，通过选择性地激发聚焦点内的荧光，抑制了背景荧光的产生，在更深处脑区比单光子显微镜更能分离细胞之间的信号，因此对大脑许多区域的荧光成像至关重要。

　　然而，GEVIs 和多光子显微镜的独特功能还没有被用于记录哺乳动物大脑中单个神经元的电压。事实上，快速多光子电压记录被认为是非常困难或不切实际的。GECIs 的多光子记录通常是通过光栅以采样率≤30Hz 扫描整个平面，适用于检测持续数百毫秒的钙瞬变。如果 GEVIs 能够足够快地跟踪由胞体产生的尖峰，或者只持续几毫秒的动作电位APs)，则需要更快1-2 个数量级的采样率。如果光栅扫描速度加快，则需要增加激光功率以保持每个体素的光子通量。此外，由于 GEVI 驻留在膜上而不是在细胞质中，所以光学切片中的 GEVI 分子数量通常比 GECIs 少，这减少了每个神经元的综合信号。

　　基于以上这些因素可以预测，多光子电压成像需要非常高的照明功率，而这又会导致快速的光损伤和光漂白。在这些约束条件下，开发更大响应性和更优动力学的 GEVIs 对于最大限度地检测神经元电活动是至关重要的。

　　2019 年 12 月 12 日，来自斯坦福大学的 Ste´ phane Dieudonne´和 Michael Z. Lin 课题组在Cell上发表了题为“Ultrafast Two-Photon Imaging of a High-Gain Voltage Indicator in Awake Behaving Mice”的文章。该文章报告了一个基因编码的荧光电压指示剂ASAP3，其 51% 的荧光可由生理电压调制，具有亚毫秒的激活动力学，并在双光子激发下完全响应。

　　文章还介绍了一种超快局部体积激发ULoVE)方法，用于双光子采样，提高了稳定性和灵敏度。结合 ASAP3 和 ULoVE，作者在深部脑区对尖峰和阈下电活动进行追踪，发现其具有亚细胞分辨率并且可以在几天内重复采样。同时发现在视觉皮层，运动可导致细胞类型依赖的阈下电压调制。因此，结合 ASAP3 和 ULoVE，可在清醒状态下的深部脑区高速地光记录转基因神经元的电活动。

　　目前，对阈下电压变化和动作电位响应最大的 GEVIs 是基于两个电压感知结构域而开发的：七个跨膜螺旋视蛋白和四个跨膜螺旋电压感知域VSDs)。基于视蛋白而开发的 GEVIs 已被用于报告由单光子激发的在体浅表神经元电活动，但其响应性在双光子激发下严重减弱。

　　相反，ASAP 家族的 GEVIs，由插入G. gallus电压感应磷酸酶的第四跨膜螺旋 VSD 中的循环排列的 GFP cpGFP)变体组成，可以完全响应双光子的激发。特别是，ASAP2s 是基于荧光蛋白的 GEVIs，可以最大响应每个动作电位，尽管其动力学比早期的 ASAP 变异体慢。因此作者想筛选到更优化的 ASAP 变异体。

　　文章中作者通过 PCR 快速生成 ASAP 变异体的基因文库，并将 PCR 产物电转到哺乳动物细胞中，根据细胞的荧光亮度自动化筛选到改进了的电压指示剂 ASAP3。ASAP3 在单光子或双光子激发下对稳态电压或动作电位的响应最大，对动作电位计时和检测都有良好的动力学，并且能有效地定位在膜上。

　　此外，作者还介绍了一种超快速局部体积激发ULoVE)策略用于双光子显微镜。实验中以高达每体积 20kHz 的功率选择性地激发膜区。作者发现第三种激发模式，即将光分散成 9 照射点，ASAP3-Kv 的光漂白比较温和，在连续以 2 – 4 kHz 记录时，前 10s 荧光损失 19.6%±4.5%，之后缓慢下降，在接下来的 5 分钟内以每分钟 0.99%±0.75% 的速率光漂白，这比一个衍射激发点高近 50 倍的耐光性。因此，ULoVE 可以通过缩短激发的停留时间或多点分散激发能量以减少光漂白。

　　接着，作者将 ASAP3-Kv 和 ULoVE 双光子显微镜在小鼠体内验证其特殊的功能，发现 ASAP3 和 ULoVE 显微镜实现了 GEVIs 的多个理论优势，即比基于单光子的方法能够报告多位置、亚细胞位置和更深脑区的阈下和尖峰电活动，并且可以持续多天检测神经元电活动。

　　作者还检测了 ASAP3-Kv 是否可以同时报告同一个神经元的电压振荡和动作电位，这代表突触功能的输入和输出。脑电振荡被广泛认为是大脑状态的标志，协调神经回路的信息处理。作者发现小鼠运动时，海马神经元中的 ASAP3-Kv 信号表现出较强的θ波振荡。另外，每一个振荡频率都与中间神经元的活动有关，GEVIs 提供了将细胞类型的活性与脑电振荡相关联的可能性。在 PV 阳性表达 Cre 重组酶的转基因小鼠海马中注射了具有 Cre 依赖 ASAP3-Kv AAV，可以观察 PV 神经元在小鼠运动时的电压变化。

　　最后，作者还检测了小鼠运动时对单个神经元电活动的调制情况，发现小鼠在休息或运动时，根据电信号特征假定是中间神经元动作电位的周围 400 毫秒的膜电位没有差异。相反，电压丛发性细胞（bursty cells）在小鼠运动时动作电位周围的去极化电位明显高于休息时的电位。该结果与先前运动诱发阈下去极化的电生理学结果一致。总之，实验结果证实了光电压记录 ASAP3-Kv 能够捕获特定细胞类型的尖峰电活动和阈下电压动态调制。